微分幹涉對比（DIC）顯微鏡是如何工作的？

DIC顯微鏡是一種使用偏振濾光器和沃拉斯頓棱鏡的傳統寬視場顯微鏡。

光源散發出的光會穿過濾光器，變成45°的偏振光。在穿過沃拉斯頓棱鏡後，光會被分成垂直偏振分量，其中一個為0°偏振，另一個為90°偏振。聚光鏡將光聚集在標本上，再由2束偏振角度不同的連貫平行光線照射到標本上。光線穿過不同的光路長度，因為其穿過樣本的路徑上可能存在厚度或折射率差異。
最後的結果是，一條光線相對於另一條光線出現相移。垂直偏振光通過物鏡和另一個沃拉斯頓棱鏡後，重新組合成135°偏振光。根據光路長度的不同，這兩束光線的幹擾會產生建設性（增亮）或破壞性（變暗）幹擾，使得原本用明場顯微鏡幾乎觀察不到的結構現在可通過DIC顯微鏡觀察到。
最後，偏振濾光器（也稱為分析儀）會將未發生任何相移的直接透射光濾除，其隻允許135°的偏振光通過。

微分幹涉對比 （DIC） 顯微鏡

使生物標本的未染色透明結構可見，這些結構在明場照明下難以看到

本文解釋了當使用顯微鏡對透明、未染色的生物標本進行成像時，微分幹涉對比 （DIC） 如何成為明場照明的良好替代方案。標本的明場圖像通常缺乏結構和細節，因為局部吸收光的強度變化很小。染色確實會在通過標本後引起光強度的差異，但染色通常可能是有毒的。DIC顯微鏡利用光程長度和相移的梯度，使透明結構可見。

未染色的標本在明場顯微鏡中通常看起來不顯眼且細節不足。但實際上，它們與醒目的光相互作用，並發生人眼無法檢測到的相移。染色會導致振幅偏移和通過的光強度的差異，但大多數情況下，這僅適用於死材料。引起光波振幅變化的標本或其結構稱為振幅物體[1]。

微分幹涉對比（DIC）顯微鏡利用光程長度和相移的梯度，使相位物體在用顯微鏡觀察時可見[2]。當光通過時引起相移的標本或其結構稱為相位物體[1]。通過這種方式，可以以足夠的對比度和分辨率觀察活細胞和生物體。DIC產生類似浮雕的圖像，其中標本的結構和特征似乎投下了陰影。它們沒有光暈偽影，並且由於光學切片的可能性，也可以對相對較厚的標本進行成像。

DIC顯微鏡技術最早由弗朗西斯·史密斯（Francis Smith）於1947年發明，但隨後由喬治·諾馬爾斯基（Georges Nomarski）於1952年進一步發展並成為實用的顯微鏡方法[2]。

對於DIC顯微鏡，僅使用偏振光來照亮標本。偏振光分散成兩條不同的光線，它們位於偏振的正交平麵上。這兩條光線彼此非常接近。當它們在樣品內以不同的方式經曆折射或散射時，就會發生不同的相移。如果這些光線重新組合，它們會相互幹擾。光現在是橢圓偏振的。這種偏振可以通過分析儀轉換為振幅偏移。通過這種方式，可以使波長在1/200（使用相機時甚至為1/1000波長）與整個波長之間的波長差異的相移可見。

明場DIC公司

圖 1：使用明場和 DIC 對比度成像的神經元。

對於非偏振光，光波相對於其傳播軸在所有方向上振蕩。然而，在線性偏振光中，所有波振蕩都具有相同的偏振角度或偏振平麵。圓極化是另一種可能的極化類型。光波振蕩遵循圓周運動並具有穩定的值，而方向則以恒定的角速度變化。橢圓偏振光是線性偏振光和圓偏振光的混合物。

偏振光可以由稱為偏振器的材料或設備產生。如果類似的組件用於確定振動平麵，則稱為分析儀。有吸收式偏振片和分束偏振片。

圖 2：偏振光示例：線性、圓周或橢圓偏振波（黑色）的組成，由線性偏振分量（紅色和灰色）疊加而成。

在DIC顯微鏡中，偏振光是通過放置在聚光鏡前麵的偏振器產生的。這種偏振光通過DIC棱鏡分裂成兩條具有垂直偏振平麵的線偏振光，DIC棱鏡更廣為人知的是沃拉斯頓棱鏡。沃拉斯頓棱鏡可以在聚光鏡的平麵上找到。標準的沃拉斯頓棱鏡由雙折射材料的兩個楔塊製成，它們在其底座上粘合在一起，並且光軸平行於外表麵並相互垂直。

圖 3：在 Wollaston 棱鏡的部分中，45° 偏振光被分成兩條垂直偏振光線，角度分別為 0° 和 90°（左）。棱鏡的第二部分隨後根據偏振改變它們的色散（右）。兩條光線在通過聚光鏡後變得平行。

通過該棱鏡的偏振光被剪切成兩個間隔很近的波，具有不同的偏轉角度：普通波和非凡波。它們具有垂直的偏振平麵，對於這兩個波，介質的行為就好像它實際上具有單個折射率一樣。波前的剪切發生在位於兩個棱鏡之間折射率結點的幹涉平麵上。光波在空間上被剪切角分開。對於整個棱鏡上所有匹配的光波，它們的方向和它們之間的距離是相同的。這兩個波之間的空間必須小於顯微鏡的分辨率極限。

因此，試樣被緊密間隔的光波對照亮，這些光波與橫向位移平行進入。如果這兩種光波與具有不同折射率或不同厚度的試樣部分相互作用，則當它們從試樣中出現時，它們的光程長度會有所不同。光程長度是光路上兩點之間的折射率和厚度的乘積。它與傳輸時間和光速有關。由於光程長度與光的傳輸時間有關，因此兩個匹配的光波之間會發生相移。

在光波穿過標本後，它們通過另一個沃拉斯頓棱鏡重新聚集在一起。現在它們相互幹擾，形成橢圓偏振光，然後通過分析儀。隻有具有明顯偏振平麵的光才能通過，因此，對於不同的光波會產生不同的振幅。相移被轉換為振幅偏移，從而導致生成的圖像中具有不同的光強度。

對於現代DIC顯微鏡，沃拉斯頓棱鏡經常被修改。一個例子是Nomarski棱鏡。它也由兩個雙折射楔塊組成，但隻有一個楔塊與沃拉斯頓棱柱中的楔塊相同。另一個是修改的，光軸是傾斜定位的。這種差異導致位於棱鏡之外的幹涉麵。因此，棱鏡可以位於物鏡的孔徑平麵之外，使DIC更易於使用。

對於DIC顯微鏡，相鄰物體點的相移差異有助於圖像的形成。試樣的細節在折射率或厚度方麵具有梯度，可以更清晰地顯示出來。由於光束彼此垂直偏振，因此通過旋轉顯微鏡載物台可以看到圖像的差異。

在進行DIC顯微鏡檢查時，請務必記住不要使用塑料基材、載玻片或蓋玻片和標本，因為許多聚合物對光具有去偏振作用，並且經常會扭曲對比度。

圖 4：非偏振光通過偏振濾光片，然後以 45° 偏振。通過渥拉斯頓棱鏡後，光被分離成垂直的偏振分量，一個偏振度為0°，另一個偏振度為90°。隨後，聚光鏡將光線引導通過樣品。樣品由兩條具有不同偏振的相幹平行光線照射。這基本上會產生兩個略微偏移的樣品明場圖像，一個是 0°，另一個是 90° 偏振光。由於光的偏振不同，這些圖像不會產生建設性或破壞性幹擾。分離的光線經曆不同的光程長度，因為它們穿過樣品的點的厚度或折射率可能存在差異。這導致一條射線與另一條射線相比發生相移。垂直偏振的光線穿過物鏡後，以135°重新組合成一條偏振光。根據光程長度的差異，兩種光線的幹涉現在會導致標本區域變亮或變暗，從而使結構看起來在明場照明下幾乎看不到。最後，直接透射的光（沒有發生任何相移）被 135° 偏振濾光片（也稱為分析儀）去除。

圖5（從左到右）：小鼠纖維質體（結締組織細胞）、Transdescantia（野花）和Micrasterias（綠藻）的DIC圖像。圖6：用具有不同分裂角度的沃拉斯頓棱鏡記錄的秀麗隱杆線蟲（蛔蟲）的DIC圖像。